Лизоцим

Трёхмерная структура лизоцима

Лизоци́м (англ. lysozyme, от др.-греч. λύσις — «развязывание, разложение» и энзим; КФ 3.2.1.17) — антибактериальный агент, фермент класса гидролаз, разрушающий клеточные стенки бактерий гидролизом пептидогликана (муреина). Главным образом лизоцим получают из белка куриных яиц[1]. Также аналогичные ферменты содержатся в организмах животных, в первую очередь, в местах соприкосновения с окружающей средой — в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, слёзной жидкости, грудном молоке, слюне, слизи носоглотки и т. д. В больших количествах лизоцим содержится в слюне, чем объясняются её антибактериальные свойства. В грудном молоке человека концентрация лизоцима весьма высока (около 400 мг/л). Это намного больше, чем в коровьем. При этом концентрация лизоцима в грудном молоке не снижается со временем, через полгода после рождения ребёнка она начинает возрастать.

Содержание

История

Содержащие лизоцим жидкости, такие как яичный белок и грудное молоко, использовались для лечения глазных инфекций ещё в Древнем Риме. На рубеже XVIII и XIX веков учёные обнаружили антибактериальные свойства лейкоцитов, коровьего молока, сенной палочки, белка куриных яиц и носовой слизи[2]. В частности, Морис Николь[fr] в 1907 году говорил о бактериолитическом действии сенной палочки[3], а Павел Николаевич Лащенков в 1909 году предположил наличие протеолитических ферментов в белке куриных яиц[4].

В 1921 году Александр Флеминг, испытывая симптомы гриппа, решил вывести из своей носовой слизи культуру микроорганизмов, вызывающих болезнь. Спустя четыре дня ему удалось вывести колонию грамположительных кокков, которым он дал промежуточное название «AF coccus». Выздоровев, он решил проверить предположение Феликса д’Эрелля о роли бактериофагов в формировании приобретённого иммунитета, добавив частицы своей носовой слизи в чашки с выращенными штаммами пневмококков, стафилококков и бактерий «AF coccus». В ходе эксперимента оказалось, что росту микроорганизмов препятствует не вирус, а наличие фермента, вызывающего лизис бактерий. Впоследствии этот фермент был обнаружен им и в других биологических жидкостях[5][6]. Алмрот Райт, руководитель Флеминга, предложил дать ферменту название «лизоцим», а чувствительным к нему бактериям — Micrococcus lysodeikticus[2].

После первоначальной эйфории в погоне за антибактериальными веществами оказалось, что лизоцим имеет малое клиническое значение в качестве антибактериального средства, и после открытия пенициллина интерес к лизоциму угас, пока не был выделен и очищен лизоцим из яичного белка курицы (HEWL).

Трёхмерная структура лизоцима впервые была получена Дэвидом Чилтоном Филлипсом (1924—1999) в 1965 году, когда он получил первую модель с помощью рентгеновской кристаллографии[7][8]. Структура была публично представлена на лекции Королевского института в 1965 году[9]. Лизоцим стал второй белковой структурой и первой ферментной структурой, которая была получена с помощью рентгеновской кристаллографии, и первым ферментом, который содержит полную последовательность всех двадцати стандартных аминокислот[10].

HEWL — лизоцим, выделенный из яичного белка курицы

HEWL представляет собой полипептидную цепь (14,3 кДа), содержащую 129 аминокислотных остатков с четырьмя внутримолекулярными дисульфидными мостиками и изоэлектрической точкой вблизи ≈ 11,3; он легко растворим в водной среде.[11]

Являясь ферментом, HEWL катализирует гидролиз B-1,4 гликозидной связи между N-ацетилмурамовой кислотой и N-ацетилглюкозамином в пептидогликане клеточной стенки бактерий. Исторически сложилось так, что этот белок является одним из наиболее изученных белков в области биохимии. В отличие от большинства белков, лизоцим легко кристаллизуется, и эти кристаллы имеют хорошие преломляющие свойства. Полная первичная структура HEWL впервые была освещена в 1963[12] , и чуть позднее, в 1965 году, была создана трёхмерная структура HEWL. Расшифровка трёхмерной структуры HEWL и HEWL-субстратного комплекса открыли путь для понимания специфики лизоцима и механизма его каталитической активности.

Исследования по агрегации HEWL стали важны, когда выяснилось, что точечные мутации в человеческом лизоциме (с которым HEWL имеет 60% идентичных последовательностей) коррелировали с наследственным системным амилоидозом[13].

Это заболевание было симптоматическим, с отложением амилоидных фибрилл человеческого лизоцима (иногда в килограммовых количествах) в почках, желудочно-кишечном тракте, лимфатических узлах, кровеносных сосудах, селезёнке и печени. Лизоцим, пожалуй, единственный фермент, который образует амилоид в естественных условиях.

Лизоцим человека

Человеческий лизоцим является гликозидазой, которая функционирует в качестве антибактериального средства. Человеческий лизоцим (ЕС 3.2.1.17) содержит 130 остатков, принадлежащих к классу С-типа, и широко распространён в различных тканях и жидкостях организма, в том числе печени, суставных хрящах, крови, слюне, слёзной жидкости и молоке[14]. Он кодируется геном, расположенным на 12-й хромосоме и состоящим из 4 экзонов и 3 интронов.[15]

Лизоцим гидролизует преимущественно B-1,4 гликозидные связи между N-ацетилмурамовой кислотой и N-ацетилглюкозамином, содержащимися в структуре пептидогликана клеточной стенки некоторых микроорганизмов, особенно грамположительных бактерий, и, следовательно, играет определённую роль в защите хозяина. Фермент заставляет сахар мурамовой кислоты находиться в напряжённой конформации, и при совместном действии двух ключевых остатков — глутаминовой кислоты в положении 35 и аспарагиновой кислоты в положении 52 — гидролизует гликозидные связи.

Лизоцим интенсивно экспрессируется в кроветворных клетках, где он находится в гранулоцитах, моноцитах и макрофагах, а также в их предшественниках в костном мозге. Обычная концентрация лизоцима в плазме составляет от 4 до 13 мг/л, но только следы его можно увидеть в моче здоровых лиц. В случае нормальных субъектов, по меньшей мере, 500 мг лизоцима производятся в день, но время жизни протеина в плазме является очень коротким; 75 % элюируют в течение 1 ч, в основном, через почки[16]. Сильно повышенные концентрации лизоцима в плазме и моче связаны с целым рядом патологических состояний и мониторятся в течение многих лет, так как являются возможным маркером моноцитарного лейкоза, но в то же время, как в случае больных с миелопролиферативными расстройствами, при нормальной функции почек, производство лизоцима увеличивается до 4 раз.

За последние 30 лет человеческий лизоцим и HEWL были использованы в качестве системы отсчёта для изучения многих аспектов структуры и функции белков, в том числе стабильности белка и механизма его сворачивания. Были установлены шесть природных мутаций в человеческом лизоциме[17] , и аминокислотные замены (все расположены в B-домена области нативной структуры лизоцима)[18]. Мутации приводят к появлению нескольких вариантов белка (I56T, F57I, W64R, D67H, T70N и F57I / T70N или W112R / T70N). Все эти варианты, кроме T70N, были связаны с системными амилоидозами с участием почек, печени и селезёнки[13], в то время как не амилоидогенный вариант T70N является довольно распространённым явлением в нормальной британской популяции.

Применение

В пищевой промышленности зарегистрирован в качестве пищевой добавки E1105 (консервант).

В медицине в качестве местного антисептического средства[19].

Применение при беременности

1 триместр 2 триместр 3 триместр
Противопоказан, большинство врачей считает приём лекарства в это время нежелательным и опасным. Разрешён, под врачебным наблюдением. Приём допустим, но с учётом возможной аллергии. Не перед родами.[20]

Механизм лизиса

Фермент атакует пептидогликаны (в частности, муреин), входящие в состав клеточных стенок бактерий (особенно много его в клеточных стенках грам-положительных бактерий — до 50-80 %). Лизоцим гидролизует β(1→4)-гликозидную связь между N-ацетилмурамовой кислотой и N-ацетилглюкозамином. Пептидогликан при этом связывается с активным центром фермента (в форме кармана), расположенным между двумя его структурными доменами. Сорбционный центр лизоцима представляет 6 карманов (A, B, C, D, E, F), причём в A, C и E может связываться только N-ацетилглюкозамин, а в B, D и F — как N-ацетилглюкозамин, так и N-ацетилмурамовая кислота. Молекула субстрата в активном центре принимает конформацию, близкую к конформации переходного состояния. В соответствии с механизмом Филлипса, лизоцим связывается с гексасахаридом, затем переводит 4-й остаток в цепи в конформацию твист-кресла. В этом напряжённом состоянии гликозидная связь между центрами D и E легко разрушается. Ингибитором лизоцима служит, в частности, трисахарид N-ацетилглюкозамина, связывающийся с каталитически неактивными центрами A, B и C и препятствующий связыванию субстрата.

Остатки глутаминовой кислоты (Glu35) и аспарагиновой кислоты (Asp52) критичны для функционирования фермента, причём Asp52 ионизирован, а Glu35 нет. Некоторые авторы полагают, что Glu35 выступает в качестве донора протона при разрыве гликозидной связи субстрата, разрушая связь, а Asp52 выступает в роли нуклеофила, при образовании интермедиата — гликозил-фермента. Затем гликозил-фермент реагирует с молекулой воды, в результате чего фермент возвращается в исходное состояние и образуется продукт гидролиза[21].

Другие авторы полагают, что реакция протекает через образование карбоксоний-иона, стабилизированного заряженной карбоксильной группой Asp52, в то время как высвобождение спирта катализируется по механизму общего основного катализа незаряженным карбоксилом Glu35.[22].

Примечания

  1. G. Alderton, W.H. Ward, H.L. Fevold. ISOLATION OF LYSOZYME FROM EGG WHITE (англ.) // Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing Papers of a Biological Character : journal. — 1945. — No. 157. — P. 43—58.
  2. 1 2 Hugh A. Mckenzie, Frederick H. White. Lysozyme and α-Lactalbumin: Structure, Function, and Interrelationships (англ.) // Advances in Protein Chemistry. — Academic Press, 1991. — Vol. 41. — P. 173—315. — ISSN 0065-3233. — DOI:10.1016/S0065-3233(08)60198-9.
  3. Maurice Nicolle. Action du "Bacillus subtilis" sur diverses bactéries (фр.) // Annales de l'Institut Pasteur : journal de microbiologie. — 1907. — Vol. 21, no 8. — P. 616.
  4. P. Laschtschenko. Uber die keimtötende und entwicklungshemmende Wirkung von Hühnereiweiß (нем.) // Zeitschrift für Hygiene und Infektionskrankheiten. — 1909. — Dezember (Bd. 64, H. 1). — S. 419—427. — ISSN 1432-1831. — DOI:10.1007/BF02216170.
  5. A. Fleming. On a Remarkable Bacteriolytic Element Found in Tissues and Secretions (англ.) // Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. — 1922. — 1 May (vol. 93, iss. 653). — P. 306—317. — ISSN 1471-2954 0962-8452, 1471-2954. — DOI:10.1098/rspb.1922.0023.
  6. Chen, W. The laboratory as business: Sir Almroth Wright's vaccine programme and the construction of penicillin. // The laboratory revolution in medicine / A. Cunningham, & P. Williams. — Cambridge, Great Britain: Cambridge University Press, 1992. — P. 245—292. — ISBN 0-521-40484-3.
  7. Blake C. C., Koenig D. F., Mair G. A., North A. C., Phillips D. C., Sarma VR. Structure of hen egg-white lysozyme. A three-dimensional Fourier synthesis at 2 Angstrom resolution (англ.) // Nature : journal. — 1965. — Vol. 206, no. 986. — P. 757—761. — DOI:10.1038/206757a0. — PMID 5891407.
  8. Johnson L. N., Phillips DC. Structure of some crystalline lysozyme-inhibitor complexes determined by X-ray analysis at 6 Angstrom resolution (англ.) // Nature : journal. — 1965. — Vol. 206, no. 986. — P. 761—763. — DOI:10.1038/206761a0. — PMID 5840126.
  9. Johnson, L. N. The early history of lysozme (англ.) // Nat Struct Mol Biol : journal. — 1998. — Vol. 5, no. 11. — P. 942—944. — DOI:10.1038/2917. — PMID 9808036.
  10. Canfield, R. E. The Amino Acid Sequence of Egg White Lysozyme (англ.) // J Biol Chem : journal. — 1963. — Vol. 238, no. 8. — P. 2698—2707. — PMID 14063294.
  11. Wetter, L. R., Deutsch, H. F. Immunological studies on egg white proteins IV. Immunochemical and physical studies of lysozyme. // J. Biol. Chem.. — Т. 192. — С. 237—242.
  12. Canfield, R. E. The amino acid sequence of egg white lysozyme // J. Biol. Chem.. — Т. 238. — С. 2698—2707.
  13. 1 2 Pepys, M. B., Hawkins, P. N., Booth, D. R., Vigushin, D. M., Tennent, G. A., Soutar, A. K., et al. Human lysozyme gene mutations cause hereditary systemic amyloidosis. (англ.) // Nature. — Vol. 362. — P. 553—557.
  14. Reitamo, S., Klockars, M., Adinolfi, M., Osserman, E. F. Human lysozyme (origin and distribution in health and disease) // Ric. Clin. Lab.. — Т. 8. — С. 211—231.
  15. Peters, C. W., Kruse, U., Pollwein, R., Grzeschik, K. H., Sippel, A. E. The human lysozyme gene. Sequence organization and chromosomal localisation. // Eur. J. Biochem.. — № 182. — С. 507—516.
  16. Hansen, N. E., Karle, H., Andersen, V., Olgaard, K. Lysozyme turnover in man. // J. Clin. Invest.. — Т. 51. — С. 1146—1155.
  17. Pepys, M. B., Hawkins, P. N., Booth, D. R., Vigushin, D. M., Tennent, G. A., Soutar, A. K., et al.  (англ.) // Nature. — Vol. 362. — P. 553—557.
  18. Dumoulin, M., Kumita, J. R., Dobson, C. M. Normal and aberrant biological self-assembly: insights from studies of human lysozyme and its amyloidogenic variants. (англ.) // Accounts of Chemical Research (англ.). — Vol. 39. — P. 603—610.
  19. Местный антисептический препарат Лизобакт® — Публикации (недоступная ссылка). Дата обращения 30 мая 2011. Архивировано 3 октября 2011 года.
  20. Не опасен ли Лизобакт® при беременности при лечении боли в горле? (рус.), Детский сайт Малышам инфо (27 июня 2017). Дата обращения 29 июня 2017.
  21. С.Д. Варфоломеев. Химическая энзимология. — М.: Издательский центр "Академия", 2005. — С. 238—239. — ISBN 5-7695-2062-0.
  22. Э. Фёршт. Структура и механизм действия ферментов. — М.: "Мир", 1980. — С. 395—396. — DOI:577.15/.17[Ошибка: Неверный DOI!].

Литература